Gubler-Hoffman法的cDNA文库构建试剂盒!TaKaRa cDNA Library Construction Kit

利用真核生物的各种组织或细胞中的Poly(A)+ RNA合成cDNA，然后进行基因克隆，这在分子生物学实验中被广泛应用。这一技术的使用，使基因的结构解析及目的蛋白的表达等变得更为方便，
一般合成cDNA以及构建cDNA Library的方法为：
① 合成与目的Poly(A)+ RNA相互补的双链cDNA；
② 将双链cDNA与细菌或病毒来源的载体进行重组；
③ 将重组体导入细菌或真核细胞内进行扩增， 构建cDNALibrary。构建成的cDNA Library可以用于cDNA的解析，或者进一步进行体外转录或体外翻译等。
本试剂盒是以动植物由来的Poly(A)+ RNA为模板合成双链cDNA后，将双链cDNA与Plasmid Vector进行重组，构建质粒cDNA Library的试剂盒。试剂盒中使用的载体pAP3neo含有SV40启动子，可以在哺乳动物细胞内进行表达。
本试剂盒原理采用了Gubler-Hoffman法（Linker Primer法)，是一种可以控制克隆基因方向性的Directional Cloning法，
1）利用反转录酶M-MLV和Oligo（dT)18 Anchor Primer合成1st Strand cDNA。1st Strand cDNA合成时使用5-
methyl dCTP。
2）E.coli RNase H使mRNA-1st Strand cDNA杂合体中的RNA形成Nick，再使用E.coli DNA Ploymerase和E.coli DNA Ligase将RNA链置换成DNA链，合成2nd Strand cDNA。
3）使用T4 DNA Polymerase将双链cDNA末端平滑化。
4）与Adaptor连接后，使用Not I进行酶切。
5）使用Spin Column除去短链cDNA。
6）与Vector pAP3neo进行连接（Directional Cloning)。
7）利用电刺激转化法导入大肠杆菌。
8）确认克隆效率及插入片段大小等。